12個樣品硬性指標！低容量檢測系統為何難達細菌內毒素檢測標準？?

在細菌內毒素檢測領域，美國藥典（USP）、歐洲藥典（EP）和日本藥典（JP）中的細菌內毒素測試章節，均對檢測流程制定了嚴格的控制方法，這對用于光度測試的系統容量提出了明確要求。同時，美國食品藥品監督管理局（FDA）關于鱟試劑（LAL）檢測的指導文件，也對檢測系統的運行有著關鍵影響。本文將深入探討這些規定對低容量測試系統的具體影響。

一、系統測試容量規定

（一）藥典對樣品數量的硬性要求

藥典BET第1、2、3章針對不同類型測試，均明確規定最-低樣品數量為12個。無論測試是在微孔板孔、反應管，還是其他用于將樣品引入讀數儀的通道中進行，用于BET測試的儀器容量都必須至少達到12個樣品。這一規定確保了檢測過程的規范性和結果的可靠性。

（二）FDA指導文件的補充規定

FDA的指導文件同樣強調了樣品容量的重要性，并對歸檔標準曲線的使用作出規定。存檔標準曲線是預先確定的參數組，用于確定標準線以測定內毒素濃度。不過在使用存檔標準曲線前，測試實驗室必須證明標準曲線的一致性，且一致性需由使用者自行證明。此外，即便使用存檔標準曲線，也需保證12個樣品的容量以測試完整標準系列。

同時，測試中應設置標準（陽性）對照來驗證已存檔標準曲線的有效性，同時還需包含陰性對照、樣品對照和陽性產品對照，且所有對照均為一式兩份。如此一來，使用已存檔標準曲線時，檢測系統至少要能容納八個樣品。并且，已歸檔標準曲線有效的前提是標準對照品定量結果在已知標準濃度的±25%范圍內，這對測試重復性要求極-高，實際操作中可能較難實現。一旦無法恢復標準對照，測試就會無效，必須重新進行。

值得注意的是，指導文件僅在“常規測試"部分允許使用存檔曲線。在驗證試劑性能或進行干擾因素測試（抑制/增強測試）時，測試必須包含完整的標準曲線，同樣至少需要12個樣品。

二、藥典內毒素檢測的具體要求

2001年協調一致的USP、EP和JP，在內毒素檢測章節對檢測流程提出嚴格要求。所有檢測必須設置陰性對照和一系列內毒素標準品，且相關檢測步驟需重復操作。陰性對照用于驗證測試系統在無內毒素干擾時不會誤判，確認試劑無污染；標準系列至少涵蓋三種已知濃度的內毒素參考標準（RSE），通過分析每種已知標準濃度引發的反應，結合系統輸出的光密度或起始時間等數據，通常采用數學方法構建標準線，這條標準線是量化樣品內毒素濃度的關鍵依據，用于衡量樣品相對于標準品的內毒素含量。

此外，無論是干擾因素檢測，還是常規檢測，每個檢測樣品都需要額外設置陽性產品對照（PPC）。該對照由添加到樣品中的已知濃度標準內毒素構成，只有當PPC中測得的內毒素濃度處于已知濃度的50-200%范圍內時，檢測結果才有效。若超出此范圍，則表明樣品對檢測過程存在干擾，檢測結果無效，需重新進行檢測。由此可見，缺少任何一項指-定對照，內毒素檢測都無法達到藥典要求。

藥典內毒素檢測章節介紹了三種類型的檢測，其中兩種屬于預備檢測，第三種才是正式的測試，其具體操作在“光度法的三種測試類型"標題下詳細說明，表1對這三種類型的測試進行了全面概述。

三、關于存檔標準曲線和低容量測試系統需要考慮的問題

1.在無法按照USP/EP/JP標準復制標準曲線的低容量測試系統中，能否驗證LAL試劑批次的性能？

2.是否可以使用已存檔的標準曲線進行干擾因素測試，以根據USP/EP/JP要求驗證方法？

3.是否可以使用已存檔的標準曲線按照USP/EP/JP標準進行常規內毒素檢測？

4.在沒有標準對照和陰性對照的情況下，能否根據FDA指導文件使用存檔標準曲線進行常規內毒素測試？

5.能否在低容量測試系統中進行一系列測試，以滿足檢測樣品、PPC以及陽性和陰性對照的要求？

6.能否驗證存檔標準曲線的準確度和精確度？

四、結論：明確系統容量標準

綜上所述，用于光度法測試的系統若不能至少容納12個樣品，就無法嚴格符合藥典細菌內毒素測試章節的要求。1991年FDA指南文件同樣對檢測系統提出至少容納12個樣品的要求。低容量測試系統在滿足藥典及FDA指導文件規定的控制要求方面存在顯著困難，關于存檔標準曲線和低容量測試系統的諸多問題，仍需進一步深入研究與探討。