ATCC菌株復蘇算不算傳代？種子批系統+5代傳代法則破解實驗室管理難題

多年來，ATCC（美國典型培養物保藏中心）提供的微生物標準品已被CLSI（美國臨床和實驗室標準研究所）和USP（美國藥典）等國際權-威標準廣泛納入制藥及醫療質量控制體系，廣泛應用于產品質控、對照實驗及菌種鑒定。然而，盡管使用規范已高度成熟，實驗室在傳代次數管理、非參考菌株傳代閾值界定等實操環節仍存在顯著挑戰。這一問題在制藥微生物領域專業論壇（如PMFList）中持續引發討論，凸顯了制定統一操作框架的迫切性。

一、參考菌株命名差異與來源要求

參考菌株的命名差異加劇了實驗室對微生物標準品管理的困惑。在CLSI和USP的各類文件中，這類培養物被分別稱為“對照菌株"“標準培養物"“參考菌株"“測試菌株"或“質量控制菌株"，其中“參考菌株"或“參考培養物"的稱呼較為普遍。

盡管這些術語常被混用，但兩個組織均強調，參考菌株必須來源于權-威機構，ATCC（美國典型培養物保藏中心）是主要的推薦來源，這為實驗室選擇參考菌株提供了明確方向。

二、ATCC參考菌株的傳代培養體系

ATCC的參考菌株通過傳代培養制成“儲備培養物"，再通過每周或每月的定期傳代培養制成日常使用的“工作培養物"，工作培養物通常以斜面形式保存。然而，這種傳代培養方式引發了人們對其是否源自原始參考菌株的疑問。

（一）傳代計數規則的演變

核心爭議在于如何界定“一次傳代"的計數規則。

早期USP36-NF31<51>抗菌測試的原始定義為：“一次傳代指將生物體從已建立的培養基轉移到新鮮培養基的過程，所有轉移操作均計入傳代次數"。但未明確"已建立的培養物"的具體內涵。

現行USP<1117>《微生物最佳實驗室規范》對此進行了重要修訂。更新后的定義為：“傳代指微生物從活體培養物轉移至新鮮培養基并實現增殖的過程，任何形式的傳代培養均視為一次轉種/傳代。"這一修訂有效解決了原定義的模糊性，根據新定義，ATCC冷凍或凍干菌株的解凍或水化操作不計入傳代，只有將其接種至新鮮培養基并完成生長后才計為首-次傳代。

因此，將ATCC冷凍或凍干小瓶中的參考菌株復蘇制備成儲備培養物屬于首-次傳代，而將儲備培養物轉種為工作培養物則構成第二次傳代，后續每次轉種均累計增加傳代次數。通過統一術語和明確定義，為抗菌效果測試提供了清晰可追溯的傳代計數標準。  

在微生物實驗室實踐中，除ATCC官-方提供的標準菌株外，商業機構常通過“ATCC衍生"方式獲得培養物——即從ATCC參考菌株出發，經過一次或多次傳代培養獲得的菌株。

（二）“ATCC衍生"培養物的管理

在微生物實驗室實踐中，商業機構常通過"ATCC衍生"方式獲得培養物，即從ATCC參考菌株經一次或多次傳代培養所得。CLSI認可符合資質的商業菌株供應商，但要求實驗室必須關注菌株傳代歷程，從原始ATCC參考菌株到最終工作培養物，通常會經歷1-2次傳代過程。

三、參考菌株管理的推薦系統與標準

（一）種子批系統的應用

USP推薦采用種子批系統管理參考菌株，該系統與ATCC使用的系統一致。操作流程為：先將ATCC參考菌株一次性制備多個重復傳代培養物，這些源自同一代原種的重復培養物作為實驗室的初代種子庫存儲；再將初代種子培養物傳代至第二代，用于制備工作菌株的多批次培養物，以此規范實驗室參考菌株的保存流程。（圖1）

（二）傳代次數控制標準

不同標準對傳代次數的要求存在顯著差異。CLSI早期標準對傳代頻次要求模糊，后續修訂版提出三級傳代限制，但推算后原始菌株累計傳代可能達七次。而USP標準通過<1117>章節明確規定，實驗室工作培養物與ATCC參考菌株的傳代差值不得超過五次，<51>條款強調“檢測用活體微生物不得超出原始ATCC菌株五代傳代" ，這一量化標準被制藥行業廣泛采用，ATCC官-方也確認五代傳代限制是維持菌株遺傳穩定性的最佳實踐。

（三）儲存溫度與維護要求

菌株的儲存溫度對其生物學特性及存活率具有顯著影響，各標準機構對此給出了詳細指引。

1、CLSI標準

（1）原代培養物：

短期保存：-50℃至-70℃保存1年。

長期保存：-70℃以下。

延長儲存：-20℃或更低溫度（優先推薦-70℃以下）

（2）工作培養物（斜面）：

短期保存：2-8℃環境，保存周期≤4周。

2、USP36-NF31<51>條款

（1）培養物：必須儲存于液氮或-50℃以下的機械冷凍設備。

3、ATCC標準

（1）冷凍菌株：

長期保存：液氮氣相環境或-80℃機械冷凍箱（避免直接浸入液氮）。

甘油保護劑：含50%甘油的菌株可短期保存于-20℃（≤1個月），需避免溫度波動（如反復凍融）。

（2）凍干菌株：2-8℃保存。

（3）凍干菌株（斜面）：2-8℃保存≤1周。

4、特殊注意事項

質控菌株（如攜帶耐藥基因質粒）：需嚴格遵循CLSI最新標準。