血液樣本細菌內毒素檢測為何難？多重干擾和解決方法一次說清！

在生物醫學和制藥領域，準確檢測血液樣本中的細菌內毒素含量對于疾病診斷、藥物安全性評估等工作是非常重要的。然而，在利用鱟試劑（LAL）對血液樣本，包括全血、血清、血漿及其成分進行檢測分析時，往往面臨諸多挑戰，堪稱最難處理的樣本類型之一。

一、血液樣本檢測干擾因素剖析

血液是一種極其復雜的生物組織，存在多種物質，會對鱟試劑檢測造成干擾。

（一）蛋白質的中和作用

部分血液蛋白質能夠中和細菌內毒素，當采用鱟試劑對血液樣本進行定量測定內毒素濃度時，這些蛋白質會與細菌內毒素結合，給檢測結果帶來誤差。

（二）絲氨酸蛋白酶的干擾

血液中含有的絲氨酸蛋白酶，也會干擾鱟試劑檢測過程。這些蛋白酶呈現出兩種不同的干擾形式：其中一些蛋白酶會降解鱟試劑酶級聯反應中的蛋白質，導致出現抑制反應；另一些則會激活該級聯反應，導致出現假陽性結果。

（三）（1,3）-β-D-葡聚糖的影響

正常血液中除蛋白質外，還含有少量（1,3）-β-D-葡聚糖。這種物質是真菌細胞壁的成分，會激活LAL酶級聯反應。真菌感染會導致（1,3）-β-D-葡聚糖水平升高，即便其含量較低，若使用對（1,3）-β-D-葡聚糖敏感的LAL試劑檢測細菌內毒素，也極易出現假陽性結果。

（四）樣本的復雜性與個體差異

此外，血液化學成分復雜多變，受患者或捐獻者生理狀態的顯著影響。而生理狀態又受制于年齡、飲食、基因構成、健康狀況、疲勞程度、生活方式等諸多因素。因此，即便某種處理方案對多數樣本有效，仍可能存在部分樣本無法有效克服干擾的情況。

二、樣本處理的策略選擇

雖然通常需要對樣品進行一定處理，但在實施任何滅活操作前，建議先對樣品進行檢測。不同樣品的干擾程度因樣本而異，且與檢測時的稀釋度相關，有時甚至無需處理。與許多干擾LAL測試的樣品類似，對血液或血清樣本而言，稀釋樣本直至干擾消除，往往是較為有效的檢測方法。當然，通過處理樣品來中和干擾因素也具有可行性，有多種處理手段能夠使引起干擾的蛋白質變性或失去活性。

（一）熱滅活法

熱滅活法是首先值得嘗試的處理方式，該方法不僅效-果-顯-著，操作也相對簡便。不過，在某些情況下，熱滅活可能會影響細菌內毒素的表觀濃度，因為加熱會增強某些蛋白質與細菌內毒素的結合程度。為驗證熱滅活法的有效性，可以分別檢測經過熱滅活處理和未處理的樣本，并對比兩者結果。

（二）化學處理法

除熱滅活法外，還有一些化學處理手段，如添加酸或氯仿等，但這些方法僅在熱滅活無效時推薦使用。實踐表明，硝酸、洗滌劑、氫氧化鈉等處理方式，能夠有效降低各類全血樣本中的干擾。無論采用何種處理方法，每個檢測樣本都必須設置陽性產品對照，這一點至關重要。

三、試劑優化與檢測方法的匹配

在血液或血清樣本的細菌內毒素檢測中，需注重試劑與檢測方法的協同優化以確保結果可靠性。

（一）試劑優化應對葡聚糖干擾

針對樣本中（1,3）-β-D-葡聚糖對檢測的干擾問題，科德角國際合作企業美國ACC（Associates Of Cape Cod）公司推出的Glucashield®葡聚糖抑制緩沖液提供了有效解決方案。該緩沖液可與其全系列LAL試劑（涵蓋Pyrotell®凝膠法鱟試劑、Pyrotell®-T濁度法鱟試劑、Pyrochrome®顯色法鱟試劑及Chromo-LAL顯色法鱟試劑）實現精準適配。

▲Glucashield®葡聚糖抑制緩沖液

Glucashield®葡聚糖抑制緩沖液的作用機制是通過特定的化學物質與（1,3）-β-D-葡聚糖結合，屏蔽葡聚糖對酶聯反應的干擾，顯著提升細菌內毒素檢測特異性，避免因葡聚糖引發的假陽性結果，使檢測結果更真實地反映細菌內毒素水平。

（二）檢測方法的選擇與優化

不同檢測方法的適用性需根據樣本特性進行選擇。

1、凝膠法：憑借高穩定性和抗干擾能力，成為復雜生物樣本檢測的首-選方案，它通過觀察鱟試劑與細菌內毒素反應形成凝膠的情況來判斷細菌內毒素的存在與否及大致含量。在血液樣本檢測中，即使樣本存在一定程度的干擾物質，凝膠法也能相對穩定地呈現檢測結果。

2、顯色法：雖具備操作便捷性，但需警惕血漿/血清在405nm波長下的光學干擾。對此，采用含有重氮基連接的Pyrochrome®顯色法鱟試劑，通過生成540-550nm吸收波長的顯色產物，可有效規避干擾。但需要注意的是，該方法屬于終點檢測，相比動力學方法，其檢測范圍較窄。

3、光度法（含顯色/濁度法）：實施光度法（含顯色/濁度法）檢測全血樣本時，為避免血細胞造成的光學干擾，通常需要先對樣本進行離心處理。在實際操作中，光度法可能從多個稀釋度的檢測結果中得出有效數據，即陽性產品對照“加標"回收率在規定范圍內，且樣品檢測結果處于標準曲線范圍內。

然而，經常出現這樣的情況：盡管不同稀釋度下的加標回收率一致，但經稀釋校正后的細菌內毒素濃度，會隨著未加標樣品稀釋程度的變化而改變，且濃度往往隨稀釋而升高。這表明，即便加標回收率顯示無干擾，但樣品中實際測得的細菌內毒素情況說明干擾依然存在，添加的加標細菌內毒素與樣品中的細菌內毒素表現存在差異。此時，可通過逐級稀釋直至加標/未加標樣本濃度趨于一致；若稀釋無效，則必須探索其他處理方法來克服干擾。在沒有其他有效處理手段的情況下，合理的做法是將檢測結果報告為“大于或等于檢測到的最高細菌內毒素濃度"。

四、綜合策略與技術支持

血液及血液衍生樣本在鱟試劑（LAL）檢測中常因干擾因素面臨挑戰，需通過系統的方法開發確定適宜檢測技術。盡管存在多種抗干擾策略，但優先選用簡單且經過驗證的方法更為高效，其推薦順序依次為稀釋法、熱失活法和化學處理法。此過程中，專業技術支持對檢測方案的成功至關重要，需結合樣本特性深度分析及方法學驗證，以確保結果可靠性。